黄曲霉毒素B1（AFB1）酶联免疫定量检测试剂盒使用说明

方法编号：CDC-5511

本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中AFB₁。该测试盒反应孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。定量分析时需有含450nm波长的微孔板酶标仪。

1 概要

黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物，主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以AFB₁为主，AFB₁属于强烈致癌物质，肝脏是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。

AFB₁检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和ELISA方法，本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方法，可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的AFB₁。

2 测定原理

本试剂盒采用固相酶联免疫吸附原理，利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板，加入AFB₁标准品或样品、抗AFB₁单克隆抗体进行孵育后，将未与包被抗原结合的抗体洗去；再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育，加入显色液，经过终止液终止后，用酶标仪在450nm处测定OD值。

3 提供的物品

----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB₁-BSA

----5个浓度的AFB₁标准溶液（各0.5mL）

标准1：0ng/mL…………………………………………………………….直接使用

标准2：0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用

标准3：0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用

标准4：0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用

标准5：1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

----抗AF B₁单克隆抗体溶液（6mL）……………………………………………直接使用

----酶标物（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----显色液（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----终止液（6mL）…………………………………………………………………直接使用

----浓缩洗液（30mL）..……………………………………………………………稀释使用

4 盒中未提供，需自备物品

----微孔板酶标仪（可于450nm处测定）、振荡器、粉碎机、微量移液器

----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸

----氯化钠（分析纯）、甲醇（分析纯）、去离子水或蒸馏水

5 操作者注意事项

       ----标准溶液中含有黄曲霉毒素，应特别小心。

----使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡过夜。

----终止液含有硫（此处空白）酸，避免接触皮肤。

----每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

----每步加样时间应控制在5min内。

----孵育过程中应避光。

----不要使用过期试剂盒。

       ----不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂。

6 储存条件

       ----保存试剂盒于2~8℃。不要冷冻.

       ----显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

       ----将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2~8℃保存。

7 试剂变质的标志

       ----标准1的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

8 样品处理

----样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存。

----取5g粉碎的有代表性的样品，加1.25g氯化钠及25mL70%甲醇-水溶液。

----强力振荡3分钟。

----用快速定性滤纸过滤。

----取1mL滤液，加水4mL进行稀释。

----取50μL稀释液进行分析。

----*根据需要可以增减样品量，但甲醇-水溶液的量也应相应增减。

9 酶免疫分析程序

----浓缩洗液为10倍浓缩液，使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。

----取所需数量的板条插入微孔架，用洗液洗涤微孔板3min×2次。

----加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，记录样品及标准的位置，每个标准和样品必须使用新的吸头。

----加入50mL抗体溶液到每个微孔（注意移液器管尖不要接触到孔中的液体，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液体。

    ----每孔加入酶标物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗涤微孔板3min×5次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液体。

    ----每孔加入显色液100mL（2滴），37℃孵育10~12min。

    ----每孔加入终止液50mL（1滴），立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，显色液和终止液需要用移液器准确量取。

10 样品浓度计算

以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标，所对应标准溶液浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。根据样品OD值与标准1OD的比值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为AFB₁浓度的对数值，求得反对数即为测定液中AFB₁浓度C（ng/mL），按下列公式计算出样品中AFB₁含量：

AFB₁含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀释后样品提取液中AFB₁含量（ng/mL）

            K：样品稀释倍数（按照本说明书中样品处理程序方法为25）

11试剂盒主要技术指标及参数

测试盒zui低检出浓度0.1ng/mL，回收率70%~120%，与AFB₂的交叉反应系数小于1%，与AFG₁的交叉反应系数为4.65%，与AFG₂交叉反应系数小于1%。试剂盒校正曲线的线性范围0.1~1.0ng/mL，试剂盒条内变异＜10%，条间变异＜15%。

附图（仅供参考）

                            AFB₁毒素浓度对数（ng/mL）